Sekelompok sahabat yang sedang mengalami krisis paruh baya memutuskan untuk menghidupkan kembali masa muda mereka dengan membuat ulang film favorit semasa remaja. Namun begitu mereka memasuki hutan, proyek nostalgia itu berubah menjadi petualangan kacau penuh kejadian tak terduga yang sama sekali di luar rencana mereka.
Film ini dibuka di Hutan Amazon, Brasil. Seorang perempuan muda bernama Ana Almeida sedang bersiap menaiki perahu bersama pasangannya. Namun, Ana tiba-tiba meninggalkannya dan kabur menggunakan sepeda motor. Ia dikejar oleh sekelompok pria yang dipimpin Joao, yang mengejarnya dengan perahu. Kejar-kejaran itu terhenti secara mengerikan ketika seekor Anaconda raksasa muncul dari air dan menyeret salah satu anak buah Joao ke dalam sungai.
Berpindah ke Buffalo, Amerika Serikat. Doug McCallister bekerja di perusahaan jasa video pernikahan. Ia selalu ingin membuat video yang sinematis dan artistik, tetapi klien-kliennya hanya menginginkan hasil yang sederhana dan membosankan. Sahabat Doug, Ronald “Griff” Griffin, adalah aktor yang kariernya mandek. Ia mendapat peran kecil di serial televisi bertema dokter, namun justru dipecat karena mencoba berakting berlebihan di luar naskah.
Suatu malam, Doug pulang ke rumah bersama istrinya Malie dan putra mereka Charlie, tanpa tahu bahwa teman-teman lamanya telah menyiapkan pesta ulang tahun kejutan. Hadir pula Griff, Kenny Trent, dan Claire Simons. Griff kemudian memutar sebuah film lama buatan mereka saat kecil berjudul “The Quatch”, film monster murahan buatan sendiri yang justru membuat semua tertawa dan bernostalgia.
Keesokan paginya, keempat sahabat itu sarapan bersama dan membicarakan kecintaan mereka pada film. Salah satu film favorit mereka adalah “Anaconda” (1997), yang sejak lama ingin mereka buat ulang. Griff mengaku telah mendapatkan hak atas waralaba Anaconda dan mengajak mereka mewujudkan impian lama tersebut. Kenny dan Claire setuju karena hidup mereka sedang tidak bahagia—terutama Kenny yang memiliki masalah kecanduan dan baru saja dipecat Doug. Namun Doug ragu, merasa proyek itu terlalu berisiko.
Meski awalnya menolak, Doug mulai menyadari bahwa ia tidak ingin menghabiskan hidupnya hanya membuat video pernikahan biasa. Ia akhirnya mendatangi Griff dan setuju ikut membuat film tersebut. Mereka menyusun anggaran, mencari pinjaman, dan Doug mulai menulis naskah.
Keempatnya berangkat ke Brasil, menyewa perahu bersama pawang ular bernama Santiago Braga, yang membawa ular bernama Heitor sebagai Anaconda untuk film mereka. Di perjalanan, mereka bertemu Ana, yang mencoba merebut perahu karena Joao semakin dekat mengejarnya. Tak punya pilihan lain, Ana akhirnya ikut bersama mereka.
Proses syuting berjalan dengan anggaran minim. Kenny menjadi kameramen, sementara Griff dan Claire menjadi pemeran utama dan mulai kembali dekat secara emosional. Situasi berubah mengerikan ketika Griff, yang ketakutan berada dekat Heitor, tanpa sengaja melempar ular itu ke sungai. Heitor terseret dan hancur oleh baling-baling perahu. Santiago sangat terpukul. Untuk menebus kesalahannya, Griff menemani Santiago mencari ular pengganti. Namun di tengah malam, Santiago diseret Anaconda ke dalam air, dan Griff melarikan diri dalam ketakutan.
Saat mencari Santiago, mereka masuk ke hutan dan menemukan sebuah mobil camper tua. Ana melumpuhkan Joao dengan senapan dan mengungkap bahwa ia adalah bagian dari kelompok penambang emas ilegal berbahaya. Di dalam camper, jasad Santiago yang setengah tercerna tiba-tiba jatuh ke kaca depan. Mereka berhadapan langsung dengan Anaconda, namun berhasil kabur setelah Doug memperbaiki mesin camper di detik-detik terakhir.
Produksi film tetap berlanjut di tengah ancaman maut. Doug mulai menjadikan Ana sebagai fokus utama film karena kemampuannya bertahan dan bertarung, membuat Griff merasa tersisih. Konflik memuncak ketika mereka melihat kru film lain yang sedang membuat reboot resmi “Anaconda” dari Sony. Griff terpaksa mengakui bahwa ia tidak pernah memiliki hak film tersebut—semua itu hanyalah kebohongan demi memperbaiki kariernya. Doug dan Griff bertengkar hebat, dan Griff pergi sendiri dengan perahu kecil.
Griff menemukan kapal kru Sony hancur dan tak ada yang selamat. Seorang asisten produksi muncul, namun langsung dimangsa Anaconda. Griff mengambil senapan dan kembali ke teman-temannya.
Ana akhirnya mengungkap jati dirinya sebagai penambang emas ilegal, sementara Joao sebenarnya adalah polisi yang memburunya. Saat Joao hendak menangkap Ana, Griff menembaknya di kaki. Ana membunuh Joao, tetapi Claire berhasil melucuti senjatanya. Tak lama kemudian, Anaconda muncul dan menyeret Ana ke dalam air hingga tewas.
Keempat sahabat itu berjalan kaki menyusuri hutan untuk pulang. Doug digigit laba-laba beracun, dan Kenny harus mengencingi kakinya untuk menetralisir racun. Saat Doug mencoba berdamai dengan Griff, ia tiba-tiba dimakan Anaconda—namun ternyata dimuntahkan kembali dan masih hidup. Mereka menggunakan Doug dan seekor babi hutan sebagai umpan; Doug berhasil kabur, sementara babi itu dimakan lagi.
Menyadari satu-satunya jalan keluar adalah membunuh Anaconda, mereka menemukan lokasi syuting reboot Sony dan alat komunikasi. Bantuan datang dari sosok tak terduga: Ice Cube, aktor asli film pertama. Dengan bahan peledak di lokasi, mereka memancing Anaconda ke jalur ledakan. Setelah beberapa percobaan, Griff menembak tangki gas dengan pistol suar, meledakkan tubuh ular tersebut. Doug menghantam kepala Anaconda dengan trofi pemberian putranya, mengakhiri teror itu.
Beberapa waktu kemudian, film ilegal mereka berjudul “The Anaconda” diputar dan mendapat sambutan hangat. Namun Sony melarang distribusi resmi. Griff dan Claire menikah, Doug membuat video pernikahan mereka dengan gaya idealnya, Kenny bangkit dari keterpurukan, dan hidup mereka berubah. Di akhir cerita, Jennifer Lopez muncul dan menawarkan Doug untuk menyutradarai reboot resmi Anaconda. Doug pun langsung pingsan.
